2001年，初出茅廬的周韻在與梁朝偉合作拍攝《濱江世貿》廣告之后，同年與香港導演王家衛的澤東電影公司簽下三部電影主演權。同年在何平導演，姜文、趙薇、中井貴一主演的古裝動作電影《天地英雄》中扮演小和尚“覺慧”，為此剃掉多年長發。
2003年，在彭浩翔執導的人物傳記電影《張愛玲》中飾演張愛玲；同年與郭曉冬主演傅華陽執導的電影處女作《桃花燦爛》。同年在李幼斌、楊恭如主演的電視劇版家庭倫理劇《我的兄弟姐妹》中飾演妹妹齊妙，是一個現代感極強的角色。同年在走私犯罪劇《西藏警察》中飾蔡藍靖。
2004年，與孫紅雷搭檔主演葉大鷹執導的電視劇《走過幸福》，她用完全自然的表演風格飾演的朱小北，讓周韻走進了千家萬戶。同年在央視投拍的都市生活劇《月上海》中飾演年輕單純的少女任雨箏。
2005年，在與夏雨共同主演都市情感劇《愛上單眼皮的男生》，在劇中飾演善良天真的宋十一。2006年，在探討當代女性情感的電視劇《你是蘋果我是梨》中飾家庭生活優越的女孩湯紅。2007年，主演姜文執導的文藝電影《太陽照常升起》，在片中飾演瘋瘋癲癲撫養兒子的瘋媽。
2009年，在陳德森執導，謝霆鋒、王學圻主演民國動周韻動圖
作電影《十月圍城》中飾阿四的未婚妻阿純。11月，在姜文自導自演，周潤發、葛優、劉嘉玲共同主演的喜劇電影《讓子彈飛》中飾演萬人迷“花姐”，讓觀眾看到了周韻萬種風情的另一面。
2010年10月，領銜主演的年代情感劇《金婚風雨情》播出，在劇中飾演美麗智慧，是事業心很強的女醫生舒曼，憑借該劇獲得第1屆亞洲彩虹獎最佳女演員獎。
2012年10月，在侯孝賢執導的文藝武俠電影《刺客聶隱娘》里出演田季安的妻子田元氏，后化身頂尖殺手精精兒。2013年，主演姜文執導的歌舞劇情電影《一步之遙》，在片中飾演上海灘最有權勢的大軍閥的女兒武六。9月，與姜文一起出席威尼斯電影節。
2016年3月17日，參加在澳門舉行第十屆亞洲電影大獎頒獎典禮，周韻憑借《刺客聶隱娘》獲最佳女配角；6月19日，周韻出席了書籍《平原上的摩西》的分享會。
2018年7月13日，與彭于晏、廖凡、許晴合作主演的動作喜劇電影《邪不壓正》上映，周韻在片中飾演裁縫關巧紅。
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