1996年，在濮存昕主演的反腐刑偵劇《英雄無悔》中飾演劉貴田，正式開始從事影視劇工作。1997年，出演電影《第九營》，該 片是馬少驊參演的首部電影作品 。
1998年，參演唐敬睿執(zhí)導(dǎo)的司法題材電視劇《大法官》在劇中飾演王玉和一角，該劇于2001年在央視一套首播；同年，參演由丁蔭楠執(zhí)導(dǎo)的“商海橫流”三部曲中的第一部《商旗》。
1999年，與巫剛聯(lián)合主演懸疑警匪劇《鐵血警魂》飾演刑警隊長連克勤；同年，出演由巴特爾執(zhí)導(dǎo)，程煜、李幼斌主演的警匪劇《我是警察》。2000年，主演歷史革命劇《平民大總統(tǒng)》，在劇中飾演“中華民國國父”孫中山，該劇以孫中山先生1912年1月1日至4月初在南京就任臨時大總統(tǒng)的91天為主線敘述。
2001年，主演歷史題材電影《風(fēng)雨十二年》，首次在大熒幕上飾演孫中山，該片以孫中山和宋慶齡從1913年結(jié)識到1925年訣別的相愛過程為主要線索，以宋慶齡為主要視角描寫二人的一生。2002年，參演張黎執(zhí)導(dǎo)的近代史劇《走向共和》，在劇中再次飾演孫中山，該劇于2003年4月在央視一套首播。
2003年，主演由強(qiáng)小路執(zhí)導(dǎo)的二十集人物傳記題材電視劇《張大千敦煌傳奇》，在劇中飾演中國國畫大師張大千，該劇講述了張大千在敦煌期間的故事；隨后，在胡玫執(zhí)導(dǎo)，陳寶國等人主演的歷史正劇《漢武大帝》中飾演竇太后的侄子竇嬰，該劇于2005年1月在中央電視臺一套黃金檔播出 。
2004年，主演以黨的十六大代表、十屆全國人大代表、全國優(yōu)秀共產(chǎn)黨員李連成為生活原型而創(chuàng)作的一部八集主旋律作品《當(dāng)家人》，在劇中飾演一心一意為群眾謀利益，帶領(lǐng)群眾艱苦創(chuàng)業(yè)、治窮致富的村黨支部書記李天明。
2005年，與陶澤如共同主演由管虎執(zhí)導(dǎo)的平實紀(jì)錄式電視劇《生存之民工》，在劇中飾演一個色厲內(nèi)荏、圓滑自私的老江湖，既可憐又可厭，善中有惡、惡中有善的河南民工謝老大；同年，主演反映唐太宗貞觀之治時期的歷史劇《貞觀之治》，在劇中飾演唐太宗、唐高宗時期的宰相，深得太宗信任的長孫無忌一角；同年，在何炅主演的古裝歷史劇《正德演義》中飾演糖人孫；接著，參演康洪雷執(zhí)導(dǎo)的犯罪題材劇情片《一針見血》；隨后，主演由陳勝利執(zhí)導(dǎo)的抗日題材諜戰(zhàn)劇《喋血1941》，該劇講述了日本侵略中國期間，關(guān)于一批黃金的斗爭、國家利益、日本侵略等方面的故事。
2006年，搭檔劉金山主演，由謝曉梅執(zhí)導(dǎo)的戰(zhàn)爭喜劇《追殺橫路靖六》，在劇中飾演文家村首戶，樂善好施的文善仁，該劇主要講述了1944年冀中平原的八路軍與日軍的斗爭故事。
2007年，主演革命戰(zhàn)爭劇《浴血堅持》，飾演老一輩無產(chǎn)階級革命家陳毅，馬少驊為了演繹好陳毅，不善騎馬的他幾次從馬上摔下還堅持拍攝；同年，參演公安刑偵題材劇《暗流》飾演李局長。
2008年，在主旋律題材電視劇《紅燈記》中飾演一號反面人物日本軍官鳩山，這是馬少驊第一次飾演反面人物；同年，與趙崢共同主演年代商界傳奇劇《當(dāng)家大掌柜》飾演一個忠義立身、充滿東方式智慧的史大掌柜肖子富；同年，在梅花黨系列諜戰(zhàn)劇《秘密列車》中飾演周明天；隨后，出演寧浩執(zhí)導(dǎo)的喜劇電影《瘋狂的賽車》，在影片中飾演扮演黃渤飾演的耿浩的師父。
2009年，與李亞鵬主演抗戰(zhàn)劇《關(guān)中槍聲》，在劇中飾演一個在當(dāng)時陜西學(xué)界、政界頗有影響的人物梁守道；同年，出演再次與管虎合作，主演革命劇《沂蒙》，并憑借該劇中的李忠厚一角提名第28屆中國電視劇飛天獎優(yōu)秀男演員；隨后，在電視劇《好大一棵樹》中飾演“100位新中國成立以來感動中國人物”之一的鄧平壽。
2010年，主演由管虎編劇并執(zhí)導(dǎo)的，現(xiàn)代都市生活題材電視劇《外鄉(xiāng)人》，在劇中飾演脾氣粗暴急躁愛算計，但是為人仗義的謝長發(fā)一角，并憑借該角色提名第25屆中國電視金鷹獎最佳男演員。
2011年，主演紀(jì)念辛亥革命100周年的史詩獻(xiàn)禮電視劇《辛亥革命》，又一次飾演孫中山，并憑借該角色提名第29屆中國電視劇飛天獎優(yōu)秀男演員；同年，參演由張黎、劉淼淼共同執(zhí)導(dǎo)的展示中國崛起的坎坷與曲折的戰(zhàn)爭歷史題材電視劇《圣天門口》；同年，參演由韓三平執(zhí)導(dǎo)，為慶祝中國共產(chǎn)黨建黨九十周年而制作的獻(xiàn)禮影片《建黨偉業(yè)》，飾演首任臨時大總統(tǒng)孫中山先生。
2013年，與于震等人共同主演抗戰(zhàn)劇《一個鬼子都不留》，在劇中飾演山西雜耍班班主，莊繼宗的結(jié)拜大哥,游擊隊隊員，后為救莊繼宗而死的李占魁一角。
2014年，在劉燁、陳寶國主演的電視劇《北平無戰(zhàn)事》中飾演林大濰一角；同年，與張國立、陳寶國共同主演電視劇《原鄉(xiāng)》，在劇中飾演老兵杜守正；隨后與薩日娜共同主演重大革命歷史題材電視劇《歷史轉(zhuǎn)折中的鄧小平》中飾演鄧小平，得到了鄧小平子女的肯定，并憑借該劇獲得第18屆北京影視春燕獎最佳男主角獎和第21屆上海電視節(jié)-白玉蘭獎杰出貢獻(xiàn)獎等榮譽(yù)。
2015年，主演丁黑執(zhí)導(dǎo)的歷史題材電視劇《馮子材》在劇中飾演清末將領(lǐng)、民族英雄馮子材；同年，再度與薩日娜合作出演由于榮光執(zhí)導(dǎo)的真人真事改編的紀(jì)實片《獨龍之子高德榮》。
2016年，主演由羅燦然執(zhí)導(dǎo)的親情勵志題材電視劇《搭錯車》，馬少驊在劇中飾演了一位以賣破爛為生，將自己的一生都奉獻(xiàn)給了收養(yǎng)的女孩阿美的啞父，該劇收視率獲得全網(wǎng)第一的好成績；同年，參演由李雪執(zhí)導(dǎo)的醫(yī)療題材都市劇《外科風(fēng)云》，在劇中飾演仁合醫(yī)院的院長傅博文一角。
2017年，主演主旋律文藝電影《匠心》，飾演性格孤傲冷僻的著名木雕工匠陸明松。
2019年8月，參演電視劇《我們的西南聯(lián)大》。9月，主演歷史電視連續(xù)劇《民為天之丁寶楨》。
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