1985年，李幼斌進入長春電影制片廠，并主演電影《死證》，27歲的他飾演一位40多歲的東北抗日聯軍的師長。1987年，李幼斌在電影《天谷》中擔任男主角。1988年，李幼斌在自己的第一部電視劇《她曾經是我的妻子》中扮演主角。1994年，在電視劇《潮起潮落》中飾演主角魯明寬。
2000年，在《非常代價》中飾演馬超。參演電影《橫空出世》。2004年在電影《驚濤駭浪》中飾演張子明，獲得第9屆華表百花最佳男演員獎提名。 2005年在電視劇《亮劍》中飾演李云龍，與童蕾、何政軍、張光北等人合作。獲得第23屆中國電視金鷹獎觀眾喜愛的男演員獎 。
2006年，主演《闖關東》，與薩日娜、劉向京、朱亞文等人合作。2007年，在電視劇《仁者無敵》中飾演皮德貴。2009年，根據紅色經典巨著《紅日》改編的同名電視劇開播，李幼斌在劇中出演國民黨高級將領張靈甫。
2010年，在諜戰劇《旗袍》中飾演錢鵬飛，與馬蘇、王志文合作。同年在夏雨主演的電視劇《師傅》中飾演老鐵。2011年，在《國門英雄》中飾演關漢生，與史蘭芽、張志堅、田子田合作。2012年，參演《老嚴有女不愁嫁》，飾演的是愛女如命，對未來女婿挑剔萬分的倔強岳父。 2013年，主演電影《雷鋒的微笑》，與萬思維、唐國強等人合作。同年在《愛的保鏢》中飾演孫海山。10月，主演懸疑劇《別讓我看見》，飾演老刑警劉玉生。2014年5月，在家庭輕喜劇《孫老倔的幸福》中，飾演孫老倔。9月，主演諜戰劇《郵差》。2015年3月，在《決戰江橋》飾演抗戰英雄馬占山將軍。 2017年11月，主演主旋律電影《中國企業家》。
2019年6月26日，李幼斌、史蘭芽夫妻首次共同出演話劇《老式喜劇》在北京人藝實驗劇場首演。 同年9月，特別出演的戰爭電影《九條命》發布了首支先導預告片；10月16日，與張明健、李君峰、吳其江等合作主演的抗戰劇《一馬三司令》首播。2020年9月30日，參加2020央視國慶晚會《“中國夢·祖國頌”——2020國慶特別節目》，講述《從長江畔到黃鶴樓》。
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