2005年，周秀娜以模特的身份參加動漫節，獲得亞軍。2006年，出演喜劇片《打雀英雄傳》；6月，出演喜劇片《新扎師妹3》；同年，出演情景喜劇《老馮日記》。2008年，出演警匪動作片《花花型警》；11月，出演由葉念琛執導的愛情喜劇片《絕代雙嬌》。
2009年6月，出演由阮世生執導的喜劇電影《矮仔多情》，在片中飾演投資基金天王藍子杰的未婚妻珠珠；10月，出演喜劇電影《死神傻了》；11月，出演驚悚電影《關人7事》，在片中飾演便利店的女店員秀娜。
2010年3月，與呂慧儀、黎諾懿等合作主演驚悚電影《惡胎》，在片中飾演心術不正的女護士郭少芳；7月，與鐘欣潼、黃圣依等合作出演運動喜劇電影《出水芙蓉》，在片中飾演魔鬼隊成員馬閱；8月，與郭富城、張靜初、吳京等合作出演變異人動作電影《全城戒備》，在片中飾演為了贏得上位與出名的目的女主播優優；10月，與楊千嬅、林峰等合作出演喜劇電影《完美嫁衣》，在片中飾演Perfect Wedding的婚禮統籌師Flora；11月，與蔣璐霞、元華等合作主演恐怖電影《僵尸新戰士》，在片中飾演與人類友好相處的僵尸一族阿斯。
2011年3月，與曾志偉、杜汶澤合作主演喜劇片《猛男滾死隊》；7月，與傅穎、羅仲謙等合作主演愛情電影《熱浪球愛戰》，在片中飾演從小生活在貝浪灣的Sharon；9月，與楊愛瑾、沈志明等合作出演愛情電影《喜愛夜蒲》；10月，出演由王晶、葉念琛執導的恐怖電影《猛鬼愛情故事》；12月，與羅仲謙、沈志明等合作主演愛情電影《婚前試愛》，在片中飾演結婚前夕因意外目睹男友澤與好友在夜總會出來，而產生誤會的打工女郎琪。
2012年1月，與蕭敬騰、曾志偉、趙正平等合作主演愛情動作喜劇電影《殺手歐陽盆栽》，在片中飾演有著冷靜頭腦與理智的電腦高手娜娜；2月，與范逸臣、鄧家佳等合作主演驚悚電影《夜店詭談》，在片中飾演一對性感妖嬈的姊妹花艾米與艾麗；7月，主演由林小鑫執導愛情電影《獵音師》，在片中飾演性感、妖嬈，亦正亦邪的吸血鬼小葉；8月，與楊冪、劉愷威等合作出演愛情懸疑電影《Hold住愛》，在片中飾演陶小磊的前女友方檬。
2013年1月，與林家棟、曾國琿等合作主演愛情電影《紙月亮》；1月21日，與方力申、李曼等聯袂主演的古裝懸疑劇《唐朝浪漫英雄》播出，在劇中飾演波斯商人的女兒陶夭夭，這也是周秀娜首次出演內地電視劇；2月，與藍正龍、謝君豪合作主演驚悚電影《電梯驚魂》，在片中飾演與院長兒子林飛相戀的醫院護士白潔；2月10日，出演由周星馳執導的古裝神話電影《西游·降魔篇》上映，在片中飾演教段小姐跳舞色誘玄奘的四煞；2月12日，與甄子丹、柯震東等合作出演的愛情電影《在一起》上映；2月24日，與鄭嘉穎、韓雪等合作主演的年代劇《葉問》播出，在劇中飾演大雜院包租婆的女兒珍妮；2月25日，與AEG新亞洲娛樂簽約；8月，與方力申、張馨予等合作主演愛情冒險電影《致命閃玩》，在片中飾演阿德的前女友Mina；9月，與杜汶澤、鄒凱光等合作主演喜劇電影《爛滾夫斗爛滾妻》；9月22日，一直關注慈善事業的周秀娜，在電影《我想結婚的時候你在哪》的開機新聞發布會上，獲頒“最美心靈藝術家獎”；10月，與李燦森、孫祖楊等合作主演驚悚電影《冷瞳》，在片中飾演內斂、端莊的富豪千金蘇雨辰；12月，與袁詠儀、邱心志等合作主演愛情片《有招沒招之愛情達人》 ；12月10日，主演由向灼執導的推理網劇《Xgirl》播出，在劇中飾演“人體測謊機”孫小美；12月13日，與汪東城、陳漢典等合作主演的時尚喜劇電影《我的美麗王國》上映，在片中飾演天資聰穎、內心純真的模特周若童。
2014年3月，主演由錢升瑋執導的東方愛情魔幻電影《非狐外傳》，在片中飾演容貌出眾，身份成謎的仙兒；6月，與鄭伊健、王菀之合作主演愛情電影《不再說分手》，在片中飾演阿森的“永遠對小姐”小嵐；8月，主演由車徑行執導的現代都市情感電影《我想結婚的時候你在哪》，在片中飾演婚紗設計師蘇菲。
2015年2月，與古天樂、張翰等合作出演偵探喜劇電影《神探駕到》；9月，與鄭中基、雨僑合作出演喜劇電影《猛龍特囧》；12月，與陳喬恩、孫藝洲等合作主演愛情電影《北京時間》，在片中飾演每天周旋在各種浮華誘惑之中的王小莫女友。
2016年1月，與吳鎮宇、江疏影等合作出演喜劇片《惡人報喜》；1月6日，與辰亦儒、沈建宏等合作主演現代都市靈異類網絡劇《美女公寓》播出，在劇中飾演流淌著妖怪血液的長腿辣妹沈亞桐；2月，與盧頌之、童冰玉等合作主演動作片《霹靂囧花》，在片中飾演性格強勢，事業心重的女拳手阿寶；7月，與鄭伊健、文凱玲等合作主演愛情網絡電影《我的極品女神》，在片中飾演擁有玫瑰一樣艷麗外貌的機器人iGirl001，她則憑借該片獲得首屆亞洲新媒體電影節最佳女演員獎。
2017年，與鄧麗欣、樂基兒合作主演愛情電影《女士復仇》，在片中飾演生活溫馨甜蜜的女飛賊Dior；2月，與胡定欣、劉心悠等合作主演古裝宮廷劇《宮心計2：深宮計》，在劇中飾演李隆基的昭儀鄭純熙；5月，與金燕玲、鄭欣宜等合演主演愛情電影《29 1》，在片中飾演保持身材，嚴格自律的自危派林若君。
2018年1月4日，周秀娜憑借電影《29 1》，獲得第六屆高登電影獎華語電影最佳女主角；2月，憑借電影《29 1》，獲得第37屆香港電影金像獎最佳女主角的提名；9月，受邀出席第六屆十大華語電影表彰典禮，獲得年度女演員獎；11月，出演動作懸疑電影《反貪風暴4》；12月，與張晉、戴夫·巴蒂斯塔等合作主演動作電影《葉問外傳：張天志》。
2019年4月，與黃宗澤、吳卓羲、關智斌等合作主演警匪劇《戰毒》，在劇中飾演毒后汪紫琪。
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